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论文上线截图

骨骼是一种动态组织，通过两种互助精湛的进程不休自我重塑：骨酿成和骨领受。为了推动骨再生医学的发展，消失骨再生的细胞和分子机制被合计是至关紧迫的。尽管力量不错将参数传递给参与免疫相干步履的细胞，但在骨骼重建手艺，免疫细胞处于压力和负荷之下，它们在免疫中的脚色尚未被十足分析。巨噬细胞是多功能的免疫系统细胞，关于机械刺激勾搭的代谢戒指至关紧迫。Piezo1是一种非选拔性钙通说念，抒发在多种组织中以传递机械信号。在这里，使用细胞张力模子询查机械拉伸对巨噬细胞表型更动过甚机制的影响。接管波折共培养系统探索巨噬细胞激活对骨髓间充质干细胞（BMSCs）的影响，以及使用跑步机跑步模子来考据体外询查的体内机制。巨噬细胞检测到的机械应变通过Piezo1导致p53的乙酰化和去乙酰化。这一进程玩忽使巨噬细胞极化为M2型，并分泌更动滋长因子-beta（TGF-β1），随后刺激BMSCs的挪动、增殖和成骨分化。敲低Piezo1禁绝了巨噬细胞向开拓表型的更动，从而影响骨骼重塑。阻断TGF-β I、II型受体和Piezo1权贵裁汰了默契增多的小鼠骨质料。总之，作家展示了机械张力通过Piezo1引起钙内流、p53去乙酰化、巨噬细胞极化为M2型和TGF-β I开释。这些事件相沿BMSC成骨。

1.机械张力勾搭巨噬细胞极化

先前的体外实验也曾证据M2型巨噬细胞不错勾搭间充质干细胞（MSCs）成骨细胞分化。作家提倡假定，机械张力将刺激M2型巨噬细胞更动，促使骨髓间充质干细胞（BMSCs）启动成骨进程。使用Phalloidin对巨噬细胞在机械拉伸前后进行染色。跟着加快期的蔓延，巨噬细胞上出现了更多的伪足，标明存在更多的M2型巨噬细胞。为了询查巨噬细胞对张力的极化反馈，运用Western blot分析M1和M2极化巨噬细胞的比例（图1B）。流式细胞术分析自大，应力转换了巨噬细胞的表型（图1C）。M2型巨噬细胞在第二小时的增多更为权贵。这些扫尾标明，张力以时刻依赖性表情导致巨噬细胞极化为M2型，张力的成果在2小频繁变得愈加彰着。因此，选拔2小时动作进一步询查的时刻点。

图1. 机械张力勾搭巨噬细胞极化

2. 张力下的巨噬细胞要求培养基促进了BMSCs的增殖和挪动

为了检修巨噬细胞繁衍的培养基对BMSCs挪动是否有影响，作家将BMSCs和巨噬细胞进行了波折共培养（图2A）。扫尾自大2小时的张力具有最大的挪动后劲（图2B），各科罚组的BMSCs均自大出权贵更高的增殖后劲，其中2小时张力的扫尾最高（图2C-D），自大出比对照组BMSCs更大的侧向挪动才略（图2E）。鉴于此，受到压力的RAW 264.7细胞的要求培养基权贵增多了BMSCs的挪动，标明它可能通过增强干细胞归巢对组织愈合产生积极影响。

图2. 张力下的巨噬细胞要求培养基促进了BMSCs的增殖和挪动

3.巨噬细胞繁衍的培养基促进BMSCs的成骨分化

为了询查巨噬细胞免疫反移交成骨分化的影响，BMSCs在不同手艺张力要求下的巨噬细胞要求培养基中被勾搭分化为成骨细胞。在2小时拉伸组中，BMSCs的成骨后劲权贵增多（图3A-B）。2小时组的矿化进度权贵高于对照组（简短两倍）。与矿化进度一致，2小时拉伸刺激的BMSCs要求培养基中Col1、Runx2、Osx和Opn的成骨mRNA和卵白抒发水平权贵上调（图3C-D）。凭证上述发现，2小时的拉伸可能通过戒指免疫环境中M2型巨噬细胞的极化来促进成骨。

图3. 巨噬细胞繁衍培养基促进骨髓间充质干细胞成骨分化

4. Piezo1关于机械力勾搭的M2型极化是必需的

为了折服为什么施加应力会影响巨噬细胞的极化，作家检测了钙离子信号。钙离子的荧光强度跟着施加张力的时刻而变化，在2小频繁钙离子的无边内流。然后作家检测了巨噬细胞中的钙相干离子通说念，发现与其他通说念比较，Piezo1的抒发止境高（图4A）。因此作家假定，张力勾搭的巨噬细胞极化与Piezo1介导的钙内流密切相干。并基于Piezo1抒发水平的数据库，在Piezo1敲低后，发现了p53信号通路（图4B）。细胞免疫荧光自大，与对照组和其他时刻点比较，张力施加后1小时乙酰化p53的荧光强度颠倒高（图4C）。此外，敲低Piezo1后增多了乙酰化p53的抒发（图4E）。由于乙酰化p53与iNOS的变化一致，作家念念知说念Piezo1的短少是否会转换巨噬细胞的极化。扫尾标明，在Piezo1激活组中险些总共的巨噬细胞齐是M2型，而Piezo1敲低组中iNOS的抒发险些是对照组的一半（图4F-G）。因此，合计Piezo1关于巨噬细胞向M2表型的更动是必不行少的。

图4. 机械勾搭的M2极化需要Piezo1

5. 敲低Piezo1破碎了BMSCs的增殖、挪动和成骨分化

Yoda1先前已被折服为Piezo1的特异性应允剂，在向培养基中添加1 μL/mL的Yoda1并施加2小时的机械张力后，不雅察到巨噬细胞中钙离子内流权贵增多（图5A）。此外，BMSCs的挪动和增殖与钙离子内流的扫尾相匹配。在Piezo1敲低后，巨噬细胞的要求培养基对BMSCs的影响很小（图5B-C）。作家进一步搜检了BMSCs的成骨分化才略。Piezo1过抒发后，巨噬细胞的上清液大大增多了BMSCs的成骨才略。相背，在巨噬细胞流露于2小时的张力后，敲低Piezo1对要求培养基中的BMSCs影响很小（图5D-F）。总体而言，Piezo1关于机械力的传递至关紧迫，致使退换机械张力是否玩忽影响巨噬细胞极化，进而影响BMSCs的挪动、增殖和成骨分化。

图5. 敲低Piezo1禁绝了骨髓间充质干细胞的增殖、挪动和成骨分化

6. M2型巨噬细胞通过分泌TGF-β1促进BMSCs的成骨分化

以上扫尾标明，Piezo1导致巨噬细胞极化为M2型，这一进程影响了BMSCs的挪动、增殖和成骨。巨噬细胞极化后产生的TGF-β1和其他细胞因子对BMSCs的成骨有影响。作家评估了张力下巨噬细胞分泌TGF-β1的抒发，扫尾自大，在2小频繁机械张力玩忽刺激TGF-β1的分泌。在不同的科罚组中，BMSCs在添加不同剂量的TGF-β1抗体到波折共培养系统后12-48小时进行的CCK8实验中自大出增殖后劲的裁汰（图6C），用0.5ug/ml TGF-β1抗体科罚的BMSCs具有最低的挪动才略（图6D），TGF-β1抗体颐养权贵裁汰了BMSCs的成骨抒发（图6E-F）。因此，作家得出论断，机械张力导致巨噬细胞极化为M2型并开释TGF-β1，反过来不错促进BMSCs的挪动、增殖和成骨分化。

图6. M2巨噬细胞通过分泌TGF-β1促进骨髓间充质干细胞成骨分化

7. 使用TGF-β受体I、II禁绝剂或Piezo1禁绝剂科罚的小鼠阐扬出较差的骨骼重塑

骨骼酿成是一个触及骨骼和免疫系统之间互相作用的复杂进程。为了询查Piezo1和TGF-β1在骨骼再生中的作用，作家开发了一个跑步模子。分散打针水、Piezo1禁绝剂（GsMTx-4）或TGF-β受体I、II禁绝剂（LY-364947）。跑步权贵增多了小鼠的骨质料，但当Piezo1被禁绝时，机械力传递也被阻断，打针GsMTx-4的小鼠骨质料险些与对照组（即不跑步组）是换取的。巨噬细胞开释的TGF-β1在TGF-β受体I、II被阻断后未能阐扬作用，导致小鼠胫骨严重骨开拓不良（图7A）；跑步组的骨小梁数目权贵增多（图7B）；跑步大大提高了F4/80阳性巨噬细胞分泌的TGF-β1，但Piezo1禁绝剂权贵禁绝了这一效应（图7C）。因此，Piezo1的禁绝大幅裁汰了巨噬细胞分泌的TGF-β1，从而减少了默契引起的体内骨质料增多。

图7. TGF-β1和Piezo1的敲低均可裁汰跑步小鼠的骨重塑

图8. 机理图

论断

总之，作家发现机械力通过Piezo1介导的变化，影响了钙离子内流、p53的乙酰化和去乙酰化，勾搭巨噬细胞极化为M2型，分泌TGF-β1，并促进BMSCs的成骨作用（图8）。这一发现标明，Piezo1介导的巨噬细胞机械信号传导是骨免疫学的基础。它为异日的临床骨创伤、骨质疏松症和骨牵引颐养提供了陈迹。

在该询查中，询查东说念主员使用了赛昂斯小动物跑步机（Sansbio，型号SA101）来进行实验操作。

小动物跑步机（SA101）

动物跑步机主要用于大小鼠过甚他动物西宾和弃旧容新询查, 可使西宾量化愈加准确；是动物体能、耐力、默契毁伤、启动养分药物、默契生理和病理等询查的必要实验设备。

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2、刺激频率可调：2-1000HZ可调；

3、刺激方式：多极性变频刺激，无刺激盲区；

4、推行信息可剪辑，包含动物属性、实验成立；

5、辅导声频率500-20KHz可调，强度可调；

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7、默契方式：匀速、多区段、自界说；

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9、数据导出：USB导出（推行信息、默契数据）；

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